固相萃取柱（SPE 柱）是实验室样品前处理的核心工具，广泛用于食品、环境、医药等领域的样品纯化与富集，能有效去除杂质、提高后续检测准确性。很多新手在操作时容易因步骤不当导致回收率低、纯度差，本文结合实用需求，详细拆解固相萃取柱的操作流程、关键要点及问题解决方案，帮你快速掌握正确用法。

一、固相萃取柱操作前必做：3 步准备工作

操作前的准备直接影响实验结果，需重点确认耗材、溶剂和工具的适配性，避免后续失误：

1. 选对固相萃取柱：根据目标物性质定类型

不同机理的 SPE 柱适用于不同极性、电荷的目标物，选错柱子会直接导致萃取失败，常见类型及适用场景需精准匹配：

反相柱（如 C18、C8）：通过疏水作用保留非极性 / 弱极性物质（如农药残留、多环芳烃），典型用于环境水样中有机污染物富集、食品中兽药残留检测；

正相柱（如硅胶、Florisil）：通过极性作用保留极性物质（如维生素、酚类），典型用于油脂样品中极性杂质去除、农产品中除草剂纯化；

离子交换柱（如 SCX、SAX）：通过离子作用保留带电物质（如氨基酸、生物碱、有机酸），典型用于生物样本（血清、尿液）中药物代谢物提取、食品中添加剂分离；

亲和柱（如免疫亲和柱）：通过特异性结合保留特定目标物（如黄曲霉毒素、抗生素），典型用于食品中痕量毒素检测、医药中杂质精准去除。

同时需确认柱容量（如 100mg/3mL、500mg/6mL），样品中目标物总量需≤柱容量（通常 100mg 填料可吸附 1-10mg 目标物），避免过载导致萃取失效。

2. 配好溶剂：4 类溶剂功能不同，纯度要达标

溶剂需根据 SPE 柱类型选择，且必须为色谱纯或分析纯（避免杂质干扰检测），具体用途需明确区分：

活化溶剂：核心作用是去除柱内杂质（如生产残留的填料碎屑、防腐剂）、活化填料活性位点。反相柱常用 “强溶剂（甲醇）+ 弱溶剂（超纯水）” 组合；正相柱常用正己烷、乙酸乙酯；离子交换柱常用含一定离子强度的缓冲液（如 0.1mol/L 盐酸）；

上样溶剂：用于溶解或稀释样品，极性需与活化后填料一致，避免目标物提前洗脱。反相柱上样溶剂含水量需≥80%；离子交换柱需根据目标物电荷调节样品 pH（如酸性目标物调至 pH=2，增强与阳离子填料的结合力）；

淋洗溶剂：仅洗脱与填料弱结合的杂质，极性介于活化溶剂与洗脱溶剂之间。反相柱常用 5%-10% 甲醇水溶液；正相柱常用 10%-20% 乙酸乙酯 - 正己烷混合液；

洗脱溶剂：需将目标物从填料上完全洗脱，极性需满足 “反相柱用强极性溶剂（如纯甲醇、乙腈），正相柱用弱极性溶剂（如甲醇、乙醇）”；离子交换柱常用高浓度盐溶液（如 1mol/L 氯化钠）或酸碱溶液。

3. 备齐工具：这些设备不能少

核心设备：固相萃取装置（负压 manifold，用于控制溶剂流速）、真空泵（需将负压稳定在 0.02-0.05MPa，避免压力过高或过低影响萃取）；

辅助工具：移液枪（1mL/10mL/50mL 规格，用于精准量取溶剂和样品）、0.22μm/0.45μm 滤膜（过滤样品中的悬浮颗粒或沉淀，防止堵塞填料）、离心管（用于样品预处理，如离心除杂）、收集管（需匹配后续分析仪器，如 10mL 离心管、2mL 色谱进样瓶）。

二、固相萃取柱核心操作：2 种机理，步骤不同（附操作要点）

固相萃取的核心是 “选择性吸附与解吸”，根据保留目标物或保留杂质的不同，操作步骤分为 “四步法” 和 “三步法”，是新手易混淆的部分，需重点区分并严格执行：

（一）机理 1：填料保留目标物（常用，如富集农药残留）

适用于目标物含量低、需富集，或样品中杂质较多需纯化的场景（如环境水样中农药残留检测、医药样品中微量成分提取），操作分 4 步，每步要点直接影响目标物回收率：

1. 活化：关键是 “不让填料干化”

操作流程：① 用 3-5 倍柱体积（BV，如 3mL 规格柱子加 9-15mL 溶剂）的强溶剂，以 1-2 滴 / 秒的流速缓慢推过填料；② 换用 3-5 倍柱体积的弱溶剂，继续缓慢冲洗，平衡填料至与上样溶剂极性一致；

核心目的：去除柱内杂质，打开填料的活性吸附位点，为后续目标物吸附做准备；

必看注意：活化后必须保持填料层被溶剂覆盖（液面高于填料 1-2mm），一旦填料干涸出现裂缝，吸附能力会骤降，需重新活化。

2. 上样：流速不能快，避免 “穿透”

操作流程：① 将预处理后的样品（已过滤除杂、调节 pH）用移液枪缓慢加入柱中；② 若样品体积较大（如 100mL 水样），可打开真空泵，通过负压控制流速≤5mL/min；

核心目的：让目标物与填料充分接触，被填料选择性吸附在表面；

必看注意：① 流速不可过快（＞5mL/min 会导致目标物 “来不及吸附”，直接随样品流出，即 “穿透”，大幅降低回收率）；② 若样品浑浊或含沉淀，必须先过 0.45μm 滤膜，否则会堵塞填料孔隙，导致后续流速极慢甚至无法推进。

3. 淋洗：只除杂质，不丢目标物

操作流程：① 加入 3-5 倍柱体积的淋洗溶剂，以 1-2 滴 / 秒的流速缓慢冲洗；② 淋洗结束后，打开真空泵抽 10-15 秒，抽干柱内残留的淋洗液；

核心目的：洗脱与填料弱结合的杂质（如食品样品中的色素、生物样品中的蛋白质），同时保留目标物；

必看注意：淋洗溶剂强度需通过预实验确定（可先测试 3%、5%、10% 甲醇水溶液等梯度浓度），强度过高会导致目标物被一同洗脱，强度过低则无法有效去除杂质；抽干时不可过度，避免填料干涸。

4. 洗脱：确保目标物 “全出来”

操作流程：① 加入 1-3 倍柱体积的洗脱溶剂，让溶剂充分浸润填料，可浸泡 1-2 分钟（增强目标物与填料的解吸效果）；② 以 1-2 滴 / 秒的流速缓慢推过填料，用干净的收集管收集洗脱液；③ 为提高回收率，可重复洗脱 1 次（换用新的洗脱溶剂），合并两次收集的洗脱液；

核心目的：将吸附在填料上的目标物完全洗脱，用于后续检测（如 HPLC、GC）；

必看注意：洗脱溶剂体积需控制在 1-5mL，避免体积过大导致后续浓缩（如氮吹）耗时过长；若目标物易挥发或氧化，收集后需立即浓缩或加入稳定剂（如加 0.1% 甲酸防止降解）。

（二）机理 2：填料保留杂质（如去除食品色素）

适用于目标物含量高、杂质少，需快速收集目标物的场景（如食品中果糖、葡萄糖的纯化，农产品中水溶性维生素的提取），操作仅 3 步，核心是 “及时收集目标物流出液”：

1. 活化：与 “保留目标物” 机理一致

用对应溶剂预处理填料（如正相柱用乙酸乙酯活化），平衡柱体极性，全程确保填料不干涸，避免影响杂质吸附效果。

2. 上样：从加样品开始，就收集流出液

操作流程：将样品溶液缓慢加入柱中，从样品第一次接触填料开始，立即将收集管接在柱出口，以 1-2 滴 / 秒的流速控制样品流出，此时目标物随溶液穿出柱子，杂质被填料吸附；

核心目的：快速分离目标物与杂质，避免目标物在柱内滞留导致损失；

必看注意：不可等样品全上完再收集，否则部分目标物会被填料短暂吸附，导致回收率降低。

3. 洗脱（收集）：确保目标物 “全洗出”

操作流程：上样结束后，继续用 3-5 倍柱体积的淋洗溶剂（与上样溶剂极性一致，如纯水）冲洗柱子，收集所有流出液（包括上样时的流出液），合并后用于后续分析；

核心目的：将柱内残留的目标物完全冲出，避免因目标物滞留导致的损失。

三、新手必知：5 个常见问题 + 解决方案（附回收率低原因）

很多人操作后会遇到 “回收率低”“纯度差”“柱子堵塞” 等问题，其实多是细节把控不当导致，对应解决方案如下：

1. 回收率低（＜70%）

核心原因：① 填料活化后干涸，活性位点失效；② 上样流速过快，目标物未吸附就 “穿透”；③ 洗脱溶剂强度不足，目标物未完全解吸；④ 柱容量过载，目标物无法被完全吸附；

解决方案：① 活化后始终保持液面覆盖填料，若干涸需重新活化；② 降低上样流速至≤5mL/min，或采用重力上样（不用负压）；③ 提高洗脱溶剂强度（如反相柱可改用甲醇 + 乙腈混合液），或增加洗脱体积、延长浸泡时间；④ 减少样品上样量，或更换更大容量的 SPE 柱（如从 100mg/3mL 换为 500mg/6mL）。

2. 洗脱液纯度差（杂质多）

核心原因：① 淋洗溶剂强度不够，与填料弱结合的杂质未被洗脱；② 样品预处理不充分，含大量色素、悬浮颗粒等干扰物；

解决方案：① 适当提高淋洗溶剂强度（如反相柱可将甲醇浓度从 5% 提升至 10%），或增加淋洗体积；② 上样前用 0.22μm 滤膜过滤样品，或先通过液液萃取（如用乙酸乙酯萃取）预处理，提前去除部分杂质。

3. 柱子堵塞，流速极慢

核心原因：① 样品中含大量悬浮颗粒或沉淀，堵塞填料孔隙；② 真空泵负压过大，导致填料被压实；

解决方案：① 样品先离心（5000rpm，5 分钟）取上清液，或用 0.45μm 滤膜过滤后再上样；② 将真空泵负压降至 0.02-0.03MPa，避免填料压实（压实后不可逆，需更换新柱）。

4. 平行实验结果差异大

核心原因：① 各次操作中溶剂流速不一致；② 溶剂体积添加错误（如活化仅用 2 倍柱体积，未达 3-5 倍要求）；③ 淋洗、洗脱阶段的浸泡时间不统一；

解决方案：① 用固相萃取装置的负压阀精准控速，或用移液枪匀速推注溶剂；② 严格按 “3-5 倍柱体积” 用量，用刻度管或移液枪精准量取溶剂；③ 统一浸泡时间（如固定为 1 分钟），避免随意调整。

5. 目标物降解（检测不到目标峰）

核心原因：① 样品 pH 不适宜，导致目标物在萃取过程中降解（如酸性目标物在碱性环境中分解）；② 洗脱后放置时间过长，目标物被氧化或挥发；

解决方案：① 上样前根据目标物性质调节样品 pH（如酸性目标物调至 pH=2-3，碱性目标物调至 pH=8-9）；② 洗脱后立即进行浓缩、定容，或加入稳定剂（如易氧化物质可加维生素 C，易挥发物质需密封低温保存），并尽快进行后续检测。

四、固相萃取柱应用场景：这些领域都在用

掌握正确操作后，固相萃取柱可广泛应用于多领域样品前处理，常见场景如下：

食品检测：去除蜂蜜中的色素、蛋白质杂质，富集鸡肉、鱼肉中的兽药残留，如氟喹诺酮类、磺胺类等；

环境监测：富集河流、湖泊水样中的多氯联苯、有机磷农药，用螯合型 SPE 柱提取土壤中的重金属（如铅、镉、汞）；

医药领域：从血清、尿液中提取抗生素、抗肿瘤药物的代谢物，纯化中药提取物，如从黄芪中提取黄芪甲苷，去除多糖、鞣质等杂质；

农产品检测：去除蔬菜（如菠菜、生菜）中的叶绿素干扰，富集水果（如苹果、葡萄）中的展青霉素、多菌灵等真菌毒素和农药残留。